miRNA定量檢測如何達(dá)到Z佳效果

 　　miRNA定量檢測在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此miRNA定量檢測使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，miRNA定量檢測一個約5kb的質(zhì)粒會結(jié)合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。現(xiàn)存對DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。
 
　　對于miRNA定量檢測，可以采用 RT-PCR，實時定量PCR，和Northern Blot等方法進(jìn)行檢測，通過信號強弱判斷目的基因的沉默效果。值得注意的是在進(jìn)行實時定量PCR時，cDNA合成要用oligo(dT)【oligo(dT)，一種引物，cDNA合成zui常用的引物是與真核細(xì)胞miRNA定量檢測分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長的oligo(dT)】，而不是隨機引物，且預(yù)擴增片段位于靶miRNA定量檢測序列中siRNA位點的上游，由于功能的執(zhí)行者是蛋白，因此還需要對蛋白水平進(jìn)行檢測，可通過Western Blot、熒光免疫檢驗法、流式細(xì)胞分析術(shù)、ELISA和表型分析等方法來檢測干擾效果。然而miRNA定量檢測zui大以及zui終的效果是細(xì)胞的代謝過程、生理生化系數(shù)等表型參數(shù)發(fā)生明顯的變化。
 
　　miRNA定量檢測一般在轉(zhuǎn)染后24小時內(nèi)發(fā)生，其引發(fā)基因沉默的程度和持續(xù)時間依賴于靶蛋白質(zhì)的降解率(turnover rate of the protein) 以及siRNA在細(xì)胞內(nèi)的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。由于miRNA定量檢測是進(jìn)入細(xì)胞后才能對蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此如何地將定量檢測轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是成功抑制基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。例如，一個siRNA分子對某特定基因的抑制效率為90%，而轉(zhuǎn)染效率為10%，那么zui后抑制蛋白表達(dá)zui后的效率只有9%，可見如何提高miRNA定量檢測的轉(zhuǎn)染效率非常重要。
 
　　1、對每個基因設(shè)計并檢測兩到四個siRNA序列：為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA應(yīng)根據(jù)miRNA定量檢測低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計。
 
　　2、選擇低GC含量的siRNA：GC含量在40～55%的siRNA比GC含量在55%以上的siRNA活性高。
 
　　3、miRNA定量檢測純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA，在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度：為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫（Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度）或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的miRNA定量檢測通常需要跑膠電泳純化【即聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）膠純化】。
 
　　通過體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成miRNA，這樣的成本相對化學(xué)合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選miRNA定量檢測的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到miRNA。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的miRNA定量檢測，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r間。畢竟，化學(xué)合成只需要定購就可以了。值得一提的是miRNA定量檢測通過體外轉(zhuǎn)錄得到的miRNA只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成較高濃度得到的效果。